Hogyan lehet inaktiválni a tripszint?
Pontszám: 4,3/5 ( 7 szavazat )Amint a sejtek leválnak, adjunk hozzá 2 térfogat előmelegített teljes táptalajt a tripszin inaktiválásához. Óvatosan diszpergálja a tápközeget úgy, hogy többször pipettázzon a sejtréteg felületére, hogy biztosítsa a sejtek >95%-ának visszanyerését.
Hogyan állíthatom le a tripszin aktivitást?
A tripszin emésztése leállítható fagyasztással vagy a reakció pH-értékének pH 4 alá csökkentésével hangyasav, ecetsav vagy trifluor-ecetsav hozzáadásával (a tripszin visszanyeri aktivitását, ha a pH 4 fölé emelkedik). Az emésztett minták -20°C-on tárolhatók.
Mi semlegesíti a tripszint?
A kalcium- és magnéziumionokat tartalmazó puffer szintén lelassítja a tripszin aktivitását. Az FBS azonban a tripszinaktivitás gátlásának hatékonyabb módja.
A szérum inaktiválja a tripszint?
A szérum inaktiválja a vesék enzimatikus emésztése során visszamaradó tripszint és a sejtek által ezt követően szintetizált proteolitikus enzimeket. A frissen tripszinezett sejteket egyrétegűvé tenyészthetjük szérum hiányában, feltéve, hogy ismételten mossuk őket a maradék tripszin eltávolítására.
Mennyi adathordozóra van szükség a tripszin deaktiválásához?
Mindaddig, amíg legalább 1:1 arányú 5-10% szérumtartalmú táptalajt használ a tripszinhez, több mint elegendő gátlásnak kell lennie, ezt követi a centrifugálás és a táptalajcsere friss tápközeggel.
Tripszinező sejtek
Hogyan lehet átadni egy cellát?
Amikor a sejtek összefolynak, egy edényből három edénybe tesszük őket, hogy szinkronizáljuk a sejtnövekedési ciklust és felkészüljünk a kísérletre. zselatin (csak öblítse le), ha nem steril, inkubálja etanollal vagy fényfürdőben UV lámpával 30 percig, majd öblítse le PBS-sel háromszor.
Mi történik, ha a sejtek túlságosan összefolynak?
1. Amikor a sejtek körülbelül 80%-ban összefolynak (a lombik felületének 80%-át sejt monoréteg borítja), akkor még a növekedés logaritmikus fázisában kell lenniük, és tovább kell tenyészteni. (Ne hagyja, hogy a sejtek túlságosan összefolyjanak, mert elkezdenek elpusztulni, és előfordulhat, hogy nem lehet helyreállítani).
Mi történik, ha tripszin nincs jelen?
Felszívódási zavar . Ha a hasnyálmirigy nem termel elegendő tripszint, felszívódási zavarnak nevezett emésztési problémát tapasztalhat – ez az élelmiszerből származó tápanyagok emésztési vagy felszívódási képességének csökkenése. A felszívódási zavar idővel az alapvető tápanyagok hiányát okozza, ami alultápláltsághoz és vérszegénységhez vezethet.
Miért kell inaktiválnunk a tripszint?
A tripszinezési folyamat során az extracelluláris fehérjék megemésztődnek, ami a sejtek leválásához vezet a tenyészedény aljáról. A tripszin inaktiválására szérumot tartalmazó sejttenyésztő tápközeget adnak hozzá, különben a folyamatban lévő proteolízis sejtkárosodáshoz vezet.
A tripszin képes lizálni a sejteket?
A tripszinizáció a sejt disszociációjának folyamata, amelynek során tripszint, egy proteolitikus enzimet használnak, amely lebontja a fehérjéket, hogy leválasztja a tapadó sejteket az érből, amelyben tenyésztik. Sejttenyészethez adva a tripszin lebontja azokat a fehérjéket, amelyek lehetővé teszik a sejtek számára, hogy az érhez tapadjanak.
Milyen hatásai vannak a tripszin inhibitoroknak?
Versenyez a fehérjékkel a tripszinhez való kötődésért, ezért nem teszi lehetővé a fehérjékkel való kötődését az emésztési folyamathoz. Ennek eredményeként az emésztési tevékenységet megzavaró proteázgátlók táplálkozás- ellenes hatást fejtenek ki . Ezért a tripszin inhibitort táplálkozásellenes faktornak vagy ANF-nek tekintik.
Milyen fehérjét bont le a tripszin?
A tripszin lehasítja az arginin karboxilcsoportja vagy a lizin karboxilcsoportja és a szomszédos aminosav aminocsoportja közötti peptidkötést. A hasítás sebessége lassabban megy végbe, ha a lizin és az arginin a szekvenciában vagy a cisztinben található savas aminosavakkal szomszédos.
Hogyan befolyásolja a hőmérséklet a tripszint?
A hőmérséklet és a pH hatása az enzimaktivitásra és -stabilitásra. A B. licheniformis tripszin optimális reakcióhőmérséklete 65 °C volt, és azt találtuk, hogy az enzim alacsonyabb hőmérsékleten (5-25 °C) kiváló aktivitást mutat, ami ebben a hőmérsékleti tartományban a maximális aktivitás több mint 70%-át tudta megtartani.
Hol vág a tripszin?
A tripszin a peptidláncokat főként a lizin vagy arginin aminosavak karboxil oldalán vágja el. Számos biotechnológiai folyamathoz használják.
Mihez kötődik a tripszin?
A tripszin egy közepes méretű globuláris fehérje, amely a hasnyálmirigy szerinproteázaként működik. Ez az enzim a kötéseket a lizin és arginin aminosavmaradékok C-terminális oldalán lévő peptidek hasításával hidrolizálja.
Milyen pH-n denaturálódik a tripszin?
In vitro vizsgálataink azt is jelezték, hogy a tripszin lassan denaturálódik pH 6 és 4,25 között, és gyorsan 4,25 és 3,75 között. A denaturáció sebessége gyorsabb volt szobahőmérsékleten és lassabb jégben, széles pH-tartományban.
Hogyan szerezzek több tripszint?
A tripszin előállítható bakteriális vagy gombás forrásból, de leggyakrabban a sertések hasnyálmirigyéből nyerik ki (sertés tripszinnek nevezik). Más hústermelő állati forrásból is elkészíthető. A legtöbb kereskedelmi forgalomban kapható tripszin-kiegészítőt más enzimekkel kombinálják.
Miért irreverzibilis a tripszinogén a tripszinnel?
A tripszinogén az enterokináz, egy proteáz hatására tripszinné proteolizálódik . A keletkező tripszin további tripszinogén molekulákra, valamint kimotripszinogénre és prokarboxipeptidáz A-ra is hathat. Ez a fajta szabályozás visszafordíthatatlan. ... Ebben az esetben több proteáz is érintett.
Hogyan hígítod a tripszint?
A 10x tömény tripszin/EDTA oldatot vízfürdőbe helyezve melegítse elő 37 °C-ra. 2. Felengedés után aszeptikusan hígítson fel 100 ml-t a 10-szeres koncentrált oldatból 850 ml steril Ca2+ - és Mg2+-mentes sóoldattal (pl. Dulbecco's PBS), és jól keverje össze.
Mi történik, ha tripszint iszol?
Mellékhatásokat, például fájdalmat és égést okozhat . Szájon át történő bevétel esetén: Nem ismeretes eleget a tripszin más felhasználási területeinek biztonságosságáról. A tripszint más enzimekkel kombinálva alkalmazták klinikai vizsgálatok során, súlyos mellékhatásokról nem számoltak be.
Meg tudja emészteni magát a tripszin?
" A stabilizálására tett erőfeszítések nélkül a tripszin végül megemészti magát " - mondja Tracy Adair-Kirk, a MilliporeSigma vezető tudósa. Ez különösen nem kívánatos olyan alkalmazásoknál, ahol az autolízis szennyezheti és megzavarhatja a kísérleti eredményeket.
Mi történik, ha túl sok tripszin van?
Valójában leállíthatja a tripszin emésztését a TLCK-val, de ha túl sok tripszint használtunk , az semmit sem változtat az emésztés specifitásának hiányán . A TLCK lehetséges hatása a triptikus peptid detektálására/mennyiségi meghatározására vonatkozik, nem pedig a fehérje expressziójára, amely az upstream FASP technikával történik.
Mi történik, ha a sejtek 100%-ban összefolynak?
A 100%-os összefolyás azt jelenti, hogy a sejtek növekedési felületét teljesen befedik a sejtek, és nem marad több hely a sejtek egyrétegű növekedésére . A különböző sejtvonalak növekedési ütemében különbségek mutatkoznak. A legtöbb sejtet jellemzően passzálják, mielőtt teljesen konfluenssé válnának, hogy fenntartsák proliferatív fenotípusát.
Rossz dolog a sejteket két egymást követő napon tripszinezni?
Igen, káros, ha 24 órás hasadás után folyamatosan tripszinezi a sejtjeit . A hasítást 48 órás hasadás után célszerű elvégezni. ... A sejteket addig karbantarthatja, amíg a morfológia jó nem lesz (A sejttípustól függ, egyes sejtek akár 80, mások pedig 10 passzázst is áthaladhatnak).
Hányszor tud átjuttatni a sejteket?
Az ATCC általában azt javasolja, hogy a sejttenyésztést öt passzázsra korlátozzák, legalábbis az orvosi és biofarmakológiai alkalmazásokhoz.