Mi az elektroporációs küvetta?
Pontszám: 4,5/5 ( 47 szavazat )A mikrobiológiai vizsgálatokhoz ideális elektroporációs küvetták baktériumok, élesztőgombák, emlősök és növényi sejtmintákat alakítanak át elektromos mező alkalmazásával és gének bejuttatásával . A szükséges alumínium elektródalemezekkel az oldalakon a szövetkultúrával töltött tartályok megakadályozzák a statikus feltöltődést.
Hogyan használjuk az elektroporációs küvettát?
Helyezze a sejtszuszpenziót elektroporációs küvettába , és ütögesse a folyadékot a küvetta aljához . Legfeljebb 0,4 ml (400 µl) oldat helyezhető a 0,2 cm-es küvettába, és legfeljebb 80 µl a 0,1 cm-es küvettába. Vegye figyelembe, hogy a hőmérséklet jelentősen befolyásolhatja az átalakulási gyakoriságot.
Hogyan használjuk az elektroporációs gépet?
- 1. lépés: Készítse elő a sejteket. A sejteket elektroporációs pufferben szuszpendálva készítsük elő.
- 2. lépés: Alkalmazzon elektromos impulzust. Alkalmazzon elektromos impulzust a sejtekre specializált puffer és nukleinsavak jelenlétében. ...
- 3. lépés: Helyezze vissza a sejteket a növekedési körülmények közé. ...
- 4. lépés: Vizsgálja meg a sejteket.
Az elektroporációs küvetták autoklávozhatók?
A mi csoportunkban a használt küvettát csak addig dobjuk a 100%-os etanolba, amíg újra felhasználjuk. Ezután 3-szor használjuk az ioncserélt vizes öblítést. 5-szöri újrahasználat után egyszerűen kidobjuk. ... A küvettákat használat után 70%-os etanollal és ioncserélt vízzel (2-3 alkalommal) leöblítettük, majd autoklávoztuk.
Mi az elektroporáció sejttípusa?
Nem vírusos, nem mérgező , és minden sejttípuson használható, beleértve az emlősöket, baktériumokat, algákat, növényeket és élesztőket. Használható sejteken minden formában, in vitro vagy in vivo/ex vivo. Az in vitro latinul „üvegen belül” jelenti, és magában foglalja a szuszpenziós sejtet, a szövetszeletet/egész szervet és a tapadó sejtet.
Használhatók újra az elektroporációs küvetták? (5. nap)
Hogyan történik az elektroporáció?
Az elektroporáció egy egyszerű folyamaton alapul. A gazdasejteket és a kiválasztott molekulákat vezetőképes oldatban szuszpendálják, és egy elektromos áramkört zárnak le a keverék körül . Egy optimalizált feszültségű és csak néhány mikroszekundumtól egy milliszekundumig tartó elektromos impulzus kisül a sejtszuszpenzión keresztül.
Hol alkalmazzák az elektroporációt?
Az elektroporáció rendkívül hatékony idegen gének szövettenyészet-sejtekbe, különösen emlőssejtekbe történő bejuttatására is. Például kiütéses egerek előállítására , valamint daganatkezelésre, génterápiára és sejtalapú terápiára használják.
Használhatjuk újra az elektroporációs küvettákat?
A küvettákat újbóli felhasználás céljából ki kell mosni . Megfelelő mosás esetén akár 10 alkalommal is újra felhasználhatók. Minden küvettánál tegye a következőket, miközben várja, hogy a sejtek helyreálljanak: spricceljen 95%-os etanolt, hogy a küvettát több mint félig megtöltse.
Mennyi DNS-t használnak fel az elektroporációban?
A hozzáadandó DNS-oldat maximális ajánlott térfogata 2,5 µl . Nagy mennyiségű DNS hozzáadása csökkenti a transzformáció hatékonyságát. A szennyező anyagok, például a sók és a fehérjék csökkenthetik az elektroporáció hatékonyságát. Ideális esetben a transzformációhoz szükséges DNS-t meg kell tisztítani és vízben vagy TE-ben szuszpendálni.
Mi a különbség az elektroporáció és a nukleofekció között?
Kiváló transzfekciós teljesítményével a Nucleofection számos előnyt kínál a hagyományos elektroporációs módszerekkel szemben: Magas, akár 90%-os transzfekciós hatékonyság a plazmid DNS -nél és 99%-os az oligonukleotidoknál, például az siRNS-nél. A transzfektált sejtek élettani állapotának és életképességének kiváló megőrzése.
Az elektroporáció jobb, mint a hősokk?
A kémiai átalakulás és az elektroporáció összehasonlítása. Másrészt az elektroporáció általában hatékonyabb, mint a hősokk . Ennélfogva ez a módszer a DNS-mennyiségek (alacsonytól a telítő koncentrációig), a fragmentumok méretének és összetettségének szélesebb tartományára alkalmas.
Ki fedezte fel az elektroporációs módszert?
A genetikai anyag elektroporáció által közvetített szállítását először az 1990-es évek elején alkalmazta in vivo modellekre Titomirov AV (Titomirov, Sukharev és Kistanova, 1991) . Ez a módszer azon alapul, hogy bizonyos szövetekben elektromos mezőket alkalmaznak a sejtek permeabilitásának megváltoztatása érdekében.
Mi a jó időállandó az elektroporációhoz?
A tipikus időállandó 4,8-5,1 milliszekundum . Azonnal adjon hozzá 975 µl 37°C-os NEB 10-béta/Stable Outgrowth Mediumot a küvettához, óvatosan keverje fel és le kétszer, majd vigye át a 17 mm x 100 mm-es kerek fenekű tenyésztőcsőbe. Erősen rázza fel (250 ford./perc), vagy forgassa 37°C-on 1 órán át.
Hogyan alakulnak át az elektrokompetens sejtek?
- Olvassa fel az elektrokompetens cellákat jégen.
- Vigyen át 50 μl elektrokompetens cellát egy előhűtött elektroporációs küvettába, 1 mm-es hézaggal.
- Adjunk hozzá 1 μl összeszerelési terméket az elektrokompetens cellákhoz.
- Óvatosan keverje össze pipettával fel és le.
Mi az elektroporációs transzformáció?
Az elektroporáció vagy elektropermeabilizáció egy olyan transzformációs technika, amely a makromolekuláris felvétel indukcióját használja úgy, hogy a sejtfalat nagy intenzitású elektromos térimpulzusoknak teszi ki . ... Az elektroporáció kifejezetten megzavarja a lipid kettős rétegeket, ami hatékony molekuláris transzporthoz vezet a plazmamembránon keresztül.
Miért inkubálsz jégen 2 percig?
Ez azt jelenti, hogy növeljük a baktériumsejtek „kompetenciáját”, hogy a plazmid könnyebben bejusson a sejtekbe a nagyobb hősokk következtében megnövekedett pórusméret miatt. ... utoljára (de nem tudom miért) a 2-3 perces jégen történő inkubálás növeli annak esélyét, hogy a plazmid DNS bejusson a sejtbe!!
Milyen technológia a megfelelő baktériumsejtek számára?
A rekombináns DNS technológia két szervezet DNS-ének mesterséges rekombinációja. Ebben a példában a humán inzulin gént egy bakteriális plazmidba inszertáljuk. Ez a rekombináns plazmid felhasználható azután baktériumok transzformálására, amelyek képesek inzulinfehérjét termelni.
Mennyi DNS szükséges az E coli elektroporációjához?
A hozzáadandó DNS-oldat maximális ajánlott térfogata 2,5 µl . Nagy mennyiségű DNS hozzáadása csökkenti a transzformáció hatékonyságát. A szennyező anyagok, például a sók és a fehérjék csökkenthetik az elektroporáció hatékonyságát.
Miért használnak etanol 70 etanolt a küvetták mosásához?
Az etanol leöblíti a HCl-t és sterilizálja a küvettát, de mivel illékony, megkönnyíti a küvetta levegőn történő szárítását . Tehát a protokoll részletesen a következő: ... Öblítse ki a küvettát ötször 70%-os etanollal, ismét ügyelve arra, hogy a kamrák teljesen ki legyenek mosva.
Mi az a mikrolövedék módszer?
A mikrolövedékes bombázást John Sanford és Ted Klein fejlesztette ki az 1980-as évek közepén. Ezután a bombázás bizonyult a kukorica és egyéb fajok első elért transzformációjának módszerének. egyszikűek, amelyek termékeny transzformánsokat eredményeznek. Ezt később feljavítottra cserélték. Agrobacterium által közvetített protokollok.
Mit jelent az elektroporáció?
: elektromos áram alkalmazása élő felületre (például bőrre vagy sejtmembránra) annak érdekében, hogy pórusokat vagy csatornákat nyisson meg, amelyeken keresztül valami (például gyógyszer vagy DNS) áthaladhat.
Mennyi ideig tart az elektroporáció?
Az emlőssejtek elektroporációjának teljes folyamata kevesebb mint 1 órát vesz igénybe. A növényi sejtek elektroporációjához ≤6 óra szükséges a protoplasztok előkészítéséhez, és <1 óra a tényleges elektroporációs folyamathoz.
Mi a Biolistics sejttípusa?
A DNS ilyen mikrolövedékes bejuttatásával kapcsolatos technikát gyakran biolisztikának nevezik. Ez az eszköz szinte bármilyen típusú sejtet képes átalakítani, és nem korlátozódik a sejtmag átalakítására; organellumokat is képes átalakítani, beleértve a plasztidokat és a mitokondriumokat.
Hogyan válasszuk ki, hogy melyik transzformációs módszert használjuk?
1. Hogyan válasszuk ki, hogy melyik transzformációs módszert használjuk? Magyarázat: A használandó átalakítási módszer kiválasztása a végbemenő reakcióban kívánt hatékonyságon alapul . Magyarázat: A gazdaszervezetek azok a sejtek, amelyeket rekombináns molekulák szaporítására használnak.
Mi a génátvitel elektroporációs módszere?
Az elektroporáció egy egyszerű és gyors eljárás, amellyel a DNS átvihető a sejtekbe . Lényegében nagyfeszültségű impulzust adnak a sejtek és a DNS szuszpenziójára, amelyeket az elektródák közé helyeznek egy megfelelő küvettában.