Hogyan csökkenthető a háttérfestés immunfluoreszcenciában?
Pontszám: 4,9/5 ( 50 szavazat )A nem specifikus antitestkötés és ennek következtében a háttérjel csökkentése érdekében javasolt blokkoló oldat alkalmazása az antitestekkel való inkubálás előtt . A leghatékonyabb blokkoló megoldás az, amely ugyanabból a fajból származó szérumot tartalmaz, amelyben a másodlagos antitestet termelték.
Hogyan előzheti meg a háttérfoltokat?
A szövetmetszetek vastagságának csökkentése segíthet csökkenteni a háttérfestést. Vágjon vékonyabb részeket a tisztább IHC érdekében. Arra is fontos ügyelni, hogy a részek ne száradjanak ki, mivel a szárítás erős, nem specifikus festődést eredményezhet.
Hogyan optimalizálja az immunfluoreszcenciát?
- Sejtrögzítés és permeabilizáció. ...
- Antitest-specifitás. ...
- A megfelelő antitest-hígítást használva. ...
- Pufferek és blokkoló szerek optimalizálása. ...
- Megfelelő sejtsűrűség használata. ...
- Többszörös festés. ...
- Másodlagos antitestek. ...
- Háttér csökkentése.
Mi okozza a háttér elszíneződését?
A háttérfestést okozhatja az ellenanyag nem megfelelő megkötése vagy a szövetlemez elkészítése során elkövetett hibák .
A másodlagos antitestek csökkentik a háttérjeleket?
Az F(ab)-specifikus másodlagos antitestek segíthetnek csökkenteni a háttérjelet azáltal, hogy megszüntetik a másodlagos antitest által a szövetekben talált IgG fehérjék nem specifikus kötődését .
Immunhisztokémiai tippek és trükkök magas háttérrel
Mi a célja egy másodlagos antitestnek?
Bevezetés a másodlagos antitestekbe. Egy másodlagos antitest segít a célantigének kimutatásában, osztályozásában vagy tisztításában azáltal, hogy kötődik az elsődleges antitesthez , amely közvetlenül kötődik a célantigénhez.
Hogyan erősítik a másodlagos antitestek a jelet?
A másodlagos antitestek jeldetektálást és amplifikációt biztosítanak , valamint kiterjesztik az antitestek használhatóságát a fehérjékhez való konjugáció révén . A másodlagos antitestek különösen hatékonyak az immunjelölésben. A másodlagos antitestek az elsődleges antitestekhez kötődnek, amelyek közvetlenül kötődnek a célantigén(ek)hez.
Mi okozza a háttérfestést az immunhisztokémiában?
Úgy gondolják, hogy a háttérfestődés vagy a nem specifikus antitest (Ab) endogén Fc-receptorokhoz (FcR-ekhez) való kötődése, vagy ionos és hidrofób kölcsönhatások kombinációja eredményeként következik be .
Mi okozza az IHC magas hátterét?
Ok: Endogén biotin vagy lektinek Magas háttér fordulhat elő, ha az endogén biotint nem blokkolják az avidin-biotin-enzim komplex hozzáadása előtt.
Hogyan lehet csökkenteni a háttérfoltokat immunfluoreszcenciában?
A nem specifikus antitestkötés és ennek következtében a háttérjel csökkentése érdekében javasolt blokkoló oldat alkalmazása az antitestekkel való inkubálás előtt . A leghatékonyabb blokkoló megoldás az, amely ugyanabból a fajból származó szérumot tartalmaz, amelyben a másodlagos antitestet termelték.
Hogyan optimalizálja az antitesteket?
Általában az antitest-koncentrációt változtatják, miközben állandó inkubációs időt és hőmérsékletet tartanak fenn a festés optimalizálása érdekében. Hosszabb inkubációs idő is alkalmazható annak biztosítására, hogy az antitest behatoljon a szövetbe. Hosszabb inkubációs idő kombinálható alacsonyabb hőmérséklettel a specifikus kötődés elősegítése érdekében.
Hogyan optimalizálja az antitestfoltokat?
- Használja a mintájának megfelelő fixálót.
- Válassza ki a megfelelő mosószert, hogy foltos legyen a célpontja.
- Használjon megfelelő vezérlőket.
- optimalizálja az antitesthígítást és a sejtsűrűséget.
- Használjon egy másik szervezetből származó blokkoló szérumot, mint az elsődleges antitest.
- Elsődleges és másodlagos antitest optimalizálás.
Hogyan optimalizálja az antitestek hígítását?
Az antitesthígítás optimalizálása: titrálási kísérletek Minden hígítást ugyanazon a mintán kell megvizsgálni, hogy azonos kísérleti körülményeket tartsunk fenn. Sok antitestnek hasonló a tételenkénti konzisztenciája, ezért a legtöbb esetben csak egy titrálási kísérletre van szükség.
Mi történik, ha túl sok másodlagos antitestet használ?
A probléma az, hogy a másodlagos anyagok nagy koncentrációja valószínűleg nem specifikusan adszorbeálódik (kicsapódik) a membrán fehérjéin, különösen a fehérjebőséges sávokon . Ezért a lehető leggyorsabban lemosnám a membránt, és újra folytatnám az antitest-inkubálást a megfelelő hígításban.
Hogyan csökkenthetem a nem specifikus kötődésű IHC-t?
A hővel inaktivált normál szérummal vagy szarvasmarha szérumalbuminnal (BSA) végzett szövetek inkubálása általános eljárás a nem specifikus hidrofób kötődés csökkentésére. A normál szérum típusának kiválasztása fontos az elsődleges vagy másodlagos antitestekkel, illetve a festődő szövetekkel/sejtekkel való kölcsönhatások elkerülése érdekében.
Hogyan háríthatom el az IHC-t?
- Először azonosítsa az immunhisztokémiai festéssel kapcsolatos problémát az alábbi lehetőségek közül:
- Nincs elég elsődleges antitest:
- Az elsődleges és másodlagos antitestek nem kompatibilisek:
- Kiszáradt szövet:
- A sejtek nem voltak permeabilizálva:
- A paraffinmentesítés nem elegendő:
Mi okozza a nem specifikus kötődést?
Az Abs nem specifikus kötődésének lehetséges okai közül az elsődleges és másodlagos Abs-ok endogén Fc-receptorokhoz (FcR-ekhez) való vonzódását tartják a nem kívánt festődés fő forrásának. Az FcR-ek bizonyos sejtek felszínén lévő struktúrák, amelyek megkötik az Abs Fc régióját.
Mi a célja a szérum blokkolásának az immunhisztokémiában?
Mi a blokkolás az immunhisztokémiában? A blokkolás elengedhetetlen az antitestek vagy más reagensek szövethez való nem specifikus kötődésének megakadályozásához . Még ha az ellenanyagnak nagy a specifitása a célponttal szemben, az intermolekuláris erők elősegíthetik a nem specifikus kötődést más molekulákhoz.
Miért történik nem specifikus kötődés?
Hogyan történik a nem specifikus kötődés? Az NSB-t az analit és az érzékelő felülete közötti molekuláris erők okozzák, amelyek hidrofób kölcsönhatások , hidrogénkötések, Van der Waals kölcsönhatások és egyéb nem specifikus kölcsönhatások formájában jelentkezhetnek.
Hogyan kötődik egy másodlagos antitest az elsődleges antitesthez?
A másodlagos antitest egy elsődleges antitesthez kötődik, amely közvetlenül kapcsolódik a célantigénhez . Miután egy primer antitest V-régiója kötődik az antigénhez, egy jelölt másodlagos antitest hozzákapcsolja V-régióját az elsődleges antitest törzséhez vagy C-régiójához.
Miért használunk másodlagos antitesteket a Western-blotban?
A HRP másodlagos antitestek és az AP másodlagos antitestek alkalmazása ezért ideális a Western blot vizsgálathoz, mivel az alkalmazás lehetővé teszi a jel amplifikációját és a kérdéses fehérje könnyebb kimutatását egy komplex fehérjekeverék közepén .
Miért van az Elisa tesztben használt másodlagos antitest enzimmel konjugálva?
A másodlagos antitest lehetővé teszi, hogy a konjugált enzim-kromogén reakcióból származó szín intenzitása alapján számszerűsítsük, mennyi antigén-specifikus antitest van jelen a páciens szérumában .
Mi a különbség az elsődleges és a másodlagos antitest között?
Az elsődleges antitest képes közvetlenül az antigénhez kötődni, míg a másodlagos antitest nem kötődik közvetlenül az antigénhez, hanem az elsődleges antitesthez való kötődésen keresztül lép kölcsönhatásba . Ez a legfontosabb különbség az elsődleges és a másodlagos antitestek között.
Miért használnak elsődleges és másodlagos antitesteket?
Ugyanazon elsődleges antitest több különböző vizsgálati eljárásban történő alkalmazása gyakran másodlagos antitestet igényel. Az elsődleges antitest kimutatja az antigént a mintában , de a másodlagos antitestet meg lehet tervezni úgy, hogy vizualizálás céljából fluorofort vagy enzimkomplexet csatoljon hozzá.
Mihez kötődik a másodlagos antitest?
A másodlagos antitestek az elsődleges antitesthez kötődnek, és segítik a célantigének kimutatását, szétválogatását és tisztítását. A kimutatás lehetővé tételéhez a másodlagos antitestnek specifitással kell rendelkeznie az alkalmazott elsődleges ellenanyag fajtájára és izotípusára vonatkozóan, és általában konjugáltnak kell lennie.