Hogyan lehet fehérjét in vitro foszforilálni?

Pontszám: 4,4/5 ( 67 szavazat )

Ha ez a fehérje emlős eredetű, akkor könnyen foszforilálhatja a fehérjét in viro hideg ATP-vel úgy, hogy a fehérjét 5-20 percig 37 °C -on egy nyers lizátummal (1% Tritont tartalmazó enyhe pufferben lizált sejtek) 15 percig sztaurosporinnal vagy pervanadáttal aktiválja. (ortovanadát+H2O2) 1.

Hogyan foszforilezed a fehérjéket?

A fehérjefoszforiláció a fehérjék reverzibilis poszttranszlációs módosulása, amelyben egy aminosav-maradékot egy protein-kináz foszforilál kovalens kötésű foszfátcsoport hozzáadásával.

Hogyan nyerjük ki a foszforilált fehérjéket?

A folt PBST vagy TBST mosással eltávolítható. Javasoljuk, hogy ne mossa le a blotokat desztillált vízben, mivel ez bizonyos körülmények között eltávolíthatja a fehérjéket. Blokkolja a membránt 5% w/v BSA-val TBST-ben. Inkubáljuk 1 órán át 4 °C-on keverés közben.

Hogyan mérik a foszforilált fehérjét?

Foszfospecifikus antitestek fejlesztése A fehérje foszforilációjának közvetlen mérésének klasszikus módszere magában foglalja a teljes sejtek inkubációját radioaktívan jelölt 32 P-ortofoszfáttal, sejtkivonatok előállítását, a fehérjék SDS-PAGE-val történő elválasztását és filmezést.

Honnan lehet tudni, hogy egy fehérje foszforilált?

A kutatók számos technikát alkalmaznak a fehérjefoszforiláció kimutatására és mennyiségi meghatározására, beleértve a kinázaktivitási vizsgálatokat, a foszfospecifikus antitesteket , a Western-blot-t, az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatokat (ELISA), a sejtalapú ELISA-t, az intracelluláris áramlási citometriát, a tömegspektrometriát és a multianalit profilalkotást. .

Sejtjelátvitel: kinázok és foszforiláció

44 kapcsolódó kérdés található

Az ATP foszforilálható?

Oxidatív foszforiláció Egy eukarióta sejtben a reakciók a mitokondriumokon belül mennek végbe. ... Amikor az ATP defoszforilálódik , a foszfátcsoport hasítása energiát szabadít fel a sejt által felhasználható formában. Az adenozin nem az egyetlen bázis, amely AMP, ADP és ATP foszforilációján megy keresztül.

Hogyan növeli a foszforilációt?

A glükóz foszforilációja fokozható a fruktóz-6-foszfát megkötésével, és csökkenthető a fruktóz-1-foszfát megkötésével . Az étrendben elfogyasztott fruktóz a májban F1P-vé alakul. Ez tagadja az F6P hatását a glükokinázra, ami végső soron az előrehaladó reakciót kedvez.

Hogyan aktiválódnak a kinázok?

Az aktiválást a ciklikus AMP szabályozó alegységekhez való kötődése közvetíti , ami a katalitikus alegységek felszabadulását okozza. A cAPK elsősorban citoplazmatikus fehérje, de aktiválódáskor a sejtmagba vándorol, ahol a génszabályozás szempontjából fontos fehérjéket foszforilálja. Domain mozgások a protein kinázokban.

Mit jelent a foszforiláció?

Hallgassa meg a kiejtést. (fos-FOR-ih-LAY-shun) Olyan folyamat, amelyben foszfátcsoportot adnak egy molekulához , például cukorhoz vagy fehérjéhez.

Miért fontos a foszfoproteomika?

A foszfoproteomikai elemzések ideálisak a jelátviteli hálózatok dinamikájának tanulmányozására . ... A sok fehérje globális foszforilációs állapotának különböző időpontokban történő mérésének képessége ezt a megközelítést sokkal erősebbé teszi, mint a hagyományos biokémiai módszerek a jelátviteli hálózat viselkedésének elemzésére.

Leblokkolhatom a membránt egyik napról a másikra?

Ügyeljen arra, hogy blokkolja Általában 1-5%-os blokkoló oldatot javasolnak. Egy órán át szobahőmérsékleten vagy egy éjszakán át 4 fokon keverés közben blokkoljuk. A blokkoló oldatokat frissen kell készíteni, mivel a baktériumok növekedése magas hátteret okozhat.

Mi az immunprecipitációs vizsgálat?

A kromatin immunprecipitációs (ChIP) vizsgálatokat a genom azon régióinak azonosítására végezzük, amelyekhez DNS-kötő fehérjék , például transzkripciós faktorok és hisztonok társulnak. A ChIP vizsgálatok során a DNS-hez kötődő fehérjék átmenetileg térhálósodnak, és a DNS-t a sejtlízis előtt lenyírják.

Hogyan készül a lízispuffer a fehérje extrakcióhoz?

Végezzen el minden lépést elszívóernyőben.
  1. Készítsen 100 mM oldatot kétszer desztillált vízben.
  2. Állítsa a pH-t 9,0-ra HCl-lel.
  3. Forraljuk színtelenné. ...
  4. Szobahőmérsékletűre hűtjük.
  5. Állítsa újra a pH-t 9,0-ra.
  6. Forraljuk színtelenné.
  7. Ezt a ciklust addig ismételjük, amíg az oldat pH-ja 9,0 marad a forralás és lehűtés után.

Mi a protein kináz fő szerepe?

A proteinkinázok és foszfatázok olyan enzimek, amelyek katalizálják a foszfát transzfert szubsztrátjaik között . A protein-kináz katalizálja a -foszfát átvitelét az ATP-ről (vagy GTP-ről) a fehérje szubsztrátjaira, míg a protein-foszfatáz katalizálja a foszfát átvitelét egy foszfoproteinről egy vízmolekulára.

Hol történik a fehérje metilezése?

A fehérjemetiláció egy poszt-transzlációs módosítás, amelynek során metilcsoportokat adnak a fehérjékhez. Előfordulhat az arginin és a lizin nitrogéntartalmú oldalláncain , de számos különböző fehérje amino- és karboxi-terminálisain is.

Mi a protein kináz a sejtjelátvitelben?

A protein-kinázok a sejtműködés kulcsfontosságú szabályozói, amelyek az egyik legnagyobb és funkcionálisan legváltozatosabb géncsaládot alkotják. ... A kinázok különösen fontosak a jelátvitelben és az összetett funkciók, például a sejtciklus koordinálásában.

Mi a példa a foszforilációra?

Foszforilezés: Olyan biokémiai folyamat, amely során foszfátot adnak egy szerves vegyülethez. A példák közé tartozik a foszfát hozzáadása a glükózhoz glükóz-monofoszfát előállításához, valamint a foszfát hozzáadása az adenozin-difoszfáthoz (ADP) adenozin-trifoszfát (ATP) képzéséhez .

Mi a foszforiláció célja?

A foszforiláció kritikus szerepet játszik számos sejtfolyamat szabályozásában, beleértve a sejtciklust, a növekedést, az apoptózist és a jelátviteli útvonalakat. A foszforiláció a fehérjeműködés szabályozásának és a jelek sejten belüli továbbításának leggyakoribb mechanizmusa.

Hol történik a foszforiláció?

Az oxidatív foszforiláció a belső mitokondriális membránban megy végbe, ellentétben a citromsavciklus és a zsírsav-oxidáció legtöbb reakciójával, amelyek a mátrixban játszódnak le.

Mit jelent a protein kináz A?

Más protein kinázokhoz hasonlóan a protein kináz A (más néven ciklikus AMP-függő protein kináz vagy A kináz) egy olyan enzim, amely kovalensen díszíti a fehérjéket foszfátcsoportokkal . ... Ez az enzim tehát számos olyan hormon végső effektoraként működik, amelyek ciklikus AMP jelátviteli úton működnek.

Milyen típusú protein-kinázok vannak?

A protein-kináznak két fő típusa van. A legtöbbet szerin/treonin kinázok alkotják , amelyek a célpontjukban a szerin és treonin hidroxilcsoportjait foszforilezik, a többiek pedig tirozin kinázok, bár léteznek további típusok is. A protein-kinázok baktériumokban és növényekben is megtalálhatók.

Hogyan deaktiválódik az aktív protein kináz?

Protein kinázok A kináz aktiválása vagy dezaktiválása különböző módokon megy végbe: magán a kinázon keresztül cisz-foszforilációval/autofoszforilációval , aktivátor- vagy inhibitorfehérjékhez való kötődéssel vagy a sejtben való lokalizációjuk szubsztrátjukhoz viszonyított ellenőrzésével (7).

Milyen típusú reakció a foszforiláció?

A foszforiláció reverzibilis reakció ; ez azt jelenti, hogy egy foszfát molekula hozzáadható és eltávolítható. Azokat az enzimeket, amelyek felelősek azért, hogy foszfátcsoportokat adnak a fehérjékhez, „kinázoknak” nevezik. Azokat, akik részt vesznek ezen foszfátcsoportok eltávolításában, „foszfatázoknak” nevezik.

Milyen enzim katalizálja a foszforilációt?

A biokémiában a kináz egy olyan enzim, amely katalizálja a foszfátcsoportok átvitelét nagy energiájú, foszfát-donor molekulákról specifikus szubsztrátokra. Ezt a folyamatot foszforilációnak nevezik, ahol a nagy energiájú ATP-molekula egy foszfátcsoportot ad át a szubsztrát molekulának.

Milyen típusú fehérje foszforilálja a TBK-t?

A TBK1 (TANK-kötő kináz 1) egy kinázaktivitással rendelkező enzim. Pontosabban, ez egy szerin/treonin protein kináz . Emberben a TBK1 gén kódolja. Ez a kináz főként a veleszületett immunitás antivirális válaszában játszott szerepéről ismert.