Hogyan homogenizáljunk szövetet az RNS-kivonáshoz?
Pontszám: 4,4/5 ( 28 szavazat )A szövet optimális megszakítása érdekében egyetlen darab sem lehet nagyobb, mint a szonda átmérőjének fele. Öntse a darált mintát a maradék βME/RLT puffert tartalmazó csőbe. Homogenizálja a szövetet 15-20 másodperces időközönként, és az egyes intervallumok között 5 másodpercig pihenjen, összesen 60 másodpercig .
Hogyan homogenizálja a szöveteket?
A szövetmintát akkor tekintik homogenizáltnak, ha a szövetet hígító hozzáadásával olyan komponensekre bontották, amelyek lehetővé teszik a kívánt analit hatékony, egyenletes részecskeméretű extrakcióját. A tipikus arány 5:1 (térfogat/víz) hígítóoldat (ml) a szövet tömegéhez (g) a homogenizáláshoz.
Mi a homogenizálás az RNS extrakcióban?
Homogenizálás – Szerves RNS-kivonás A sejt- és szövetminták roncsolása, amelyet gyakran homogenizálással érnek el, szükséges része az RNS-ek kinyerésének és lebomlásának megakadályozásának . Valójában a minták nincsenek megvédve az RNS lebomlásával szemben, hacsak nem teljesen homogenizáltak.
Hogyan készül a szövet az RNS-kivonáshoz?
Adjon hozzá 20-50 mg gyorsfagyasztott szövetet RNS extrakciós reagenst tartalmazó csövenként . Alternatív megoldásként RNAlaterrel kezelt minták is használhatók. Ha szükséges, vágja fel a fagyasztott szövetet egy szárazjégre helyezett Petri-csészében. Csökkentse minimálisra az ehhez szükséges időt, és ne hagyja, hogy a minta felolvadjon, mielőtt RNS extrakciós reagensbe meríti.
Hogyan őrizheti meg később a szöveteket az RNS-ben?
Mielőtt bemerítené az RNAlater® oldatba, vágja le a nagy szövetmintákat ≤ 0,5 cm-es méretre bármely méretben. Helyezze a friss szövetet 5–10 térfogatnyi RNAlater® oldatba . A legtöbb RNAlater® oldatban lévő minta szobahőmérsékleten 1 hétig tárolható az RNS minőségének romlása nélkül, vagy –20°C-on vagy –80°C-on korlátlan ideig.
Hogyan izoláljunk RNS-t szövetekből vagy sejtekből
Hogyan fagyasztható le a szövet az RNS-kivonáshoz?
Egyszerűen merítse a fagyasztott szövetmintákat 10 térfogat RNAlater-ICE-be, és tárolja egy éjszakán át -20 vagy -80 ° C-on (az oldat ezen a hőmérsékleten folyékony marad). Ahogy a szövet felolvad, az RNS integritása védett.
Mennyi ideig tart az RNS kinyerése?
Az értékelt eljárások közül az RNS savas pH-n alapuló elválasztásán alapuló egyszerű módszert találtuk a legalkalmasabbnak. Körülbelül 40 perc alatt elvégezhető tíz mintán , és nem munkaigényesebb, mint a kereskedelmi készleteket használó jelenlegi módszerek.
Mi a TRIzol az RNS extrakcióban?
A TRIzol® Reagent megőrzi az RNS integritását az RNáz aktivitás rendkívül hatékony gátlása révén, miközben a minta homogenizálása során szétroncsolja a sejteket és feloldja a sejtkomponenseket.
Hogyan távolítsuk el az RNAlater-t az RNS-kivonáshoz?
Szia, Egyszerűen el kell távolítania az RNAlaterrel stabilizált szöveteket a reagensből csipesszel . Ha a teljes szövetet használja, helyezze közvetlenül egy megfelelő méretű edénybe a megbontáshoz és homogenizáláshoz, majd adjon hozzá lízispuffert, és zúzza össze a szöveteket.
Mi a homogenizálás célja?
Mindenekelőtt a homogenizálás célja a mintát alkotó részecskék méretének csökkentése . Leegyszerűsítve ez egy kicsit olyan, mintha egy sziklatömböt vennénk és kavicsba törnénk, kivéve, hogy ebben az esetben a kavicsdarabok egyforma méretűek és formájúak lennének.
Mi a DNS homogenizálása?
A homogenizálás célja a részecskeméret csökkentése és az LMO-eredetű részecskék egyenlő eloszlása . Minél kisebb a minta részecskemérete, annál több DNS-t vagy fehérjét lehet kivonni a vizsgálati részből. A homogenizálás az a lépés, ahol a legnagyobb a hiba és a szennyeződés kockázata.
Miért homogenizáljuk a szövetet?
A biológiai szöveteket rutinszerűen homogenizálják a különféle analitok (fehérjék, DNS, RNS, kis molekulák stb.) kinyerése érdekében . A szövetek homogenizálása során számos szempontot figyelembe kell venni.
Mi az a homogenizálási módszer?
Homogenizálás, egy anyag, például a tejben lévő zsírgolyócskák rendkívül kis részecskékre történő redukálása és egyenletes eloszlása a folyadékban, például a tejben. ... A folyamat során a tejet nagy nyomás alatt kis nyílásokon keresztül préselik át, így széttörik a zsírgolyócskákat.
Mi a homogenizáló hatás?
O'Connor úgy definiálja, mint " az a folyamat, amelynek során a helyi kultúrákat egy domináns külső kultúra átalakítja vagy felszívja ". ... A kulturális homogenizáció hatással lehet a nemzeti identitásra és kultúrára, amelyet „a globális kulturális iparágak és a multinacionális média hatásai erodálnának”.
A TRIzol eltávolítja a DNS-t?
A TRIzol ® reagens egy sav-guanidinium-fenol alapú reagens, amelyet ideálisan RNS (valamint DNS és fehérje) kinyerésére terveztek különféle biológiai mintákból. A TRIzol ® alacsony pH-ja (savas) szabályozza az RNS-nek a DNS-től és a fehérjétől való elválasztását , míg a magas pH az RNS és a DNS együttes izolálását okozhatja.
Mi a TRIzol szerepe az RNS extrakciókban?
A TRIzol (vagy TRI Reagent) fenol és guanidinium-izotiocianát egyfázisú oldata, amely egyszerre oldja a biológiai anyagokat és denaturálja a fehérjéket . ... A TRIzol extrakció hatékony módszer kis RNS-ek, például mikroRNS-ek, piwi-asszociált RNS-ek vagy endogén, kis interferáló RNS-ek izolálására is.
Miért használják a kloroformot az RNS-kivonáshoz?
A fázisszétválasztás elősegítésére használják, így az RNS-t a DNS-ből és a biológiai mintában lévő fehérjékből izolálják . ... A szolubilizálás után a kloroform hozzáadása fázisszétválást okoz, ahol a fehérje az alsó szerves fázisban marad, a DNS feloldódik határfelületként, és az RNS extrahálódik a felső vizes fázisba.
Milyen reagens szükséges az RNS eltávolításához?
A TRIzol reagenst főként RNS izolálására (beleértve a mikroRNS-t is), DNS izolálására és fehérje izolálására használják szövetekből vagy sejtekből.
Hány sejtre van szükség az RNS extrakcióhoz?
Általánosságban elmondható, hogy nagyon jó minőségű RNS-t kell kinyernie a sejttenyészetből, és több mint 200 000 sejtnek biztosan elegendőnek kell lennie jó néhány RT-qPCR vizsgálat elvégzéséhez.
Hogyan javítható az RNS extrakció?
Az RNS-hozam növelése érdekében a (korábban RNS-robusztus) szövetmintákban kerülje a túlzott homogenizálást vagy melegítést. A 30 másodperces sorozatokban 30 másodperces szünetekkel végzett homogenizálás javíthatja az RNS-visszanyerést. Ezenkívül több vízzel eluálva több RNS szabadul fel a membránból, ha szilícium-dioxid spinszűrőket használunk.
Hol található az RNS?
Az RNS főleg a citoplazmában található. Azonban a sejtmagban szintetizálódik, ahol a DNS transzkripción megy keresztül, hogy hírvivő RNS-t termeljen.
Hogyan használja az RNA Later oldatot?
Hogyan használhatom az RNAlater oldatot? Vágja le a szövetet legalább egy dimenzióban 0,5 cm-nél kisebbre, és egyszerűen merítse 5 térfogatnyi RNAlater oldatba (például egy 0,5 g-os mintához körülbelül 2,5 ml RNAlater oldat szükséges). A kis szervek, például a patkányvese, a máj és a lép egészben tárolhatók RNAlater oldatban.
Mi történik az RNS splicing során?
Az RNS splicing egy olyan folyamat, amely eltávolítja a gének (intronok) közbenső, nem kódoló szekvenciáit a pre-mRNS-ből, és összekapcsolja a fehérjét kódoló szekvenciákat (exonokat), hogy lehetővé tegye az mRNS fehérjévé történő transzlációját .