Hogyan lehet kimutatni a foszforilált fehérje Western blotot?
Pontszám: 4,5/5 ( 55 szavazat )A gyengén foszforilált, kis mennyiségben előforduló fehérje kimutatásához használjon antitestet a fehérje immunprecipitálására , hogy koncentrálódjon és több fehérjét töltsön be a mintasávba. A kemilumineszcenciás detektáláshoz nagyon érzékeny szubsztrátokat használjon.
Hogyan teszteli a foszforilált fehérjét?
- Bevezetés. ...
- Kináz aktivitási vizsgálatok. ...
- Foszfospecifikus antitestek fejlesztése. ...
- Western Blot. ...
- Enzim-kapcsolt immunszorbens vizsgálat (ELISA) ...
- Sejtalapú ELISA. ...
- Intracelluláris áramlási citometria és ICC/IHC. ...
- Tömegspektrometria.
Hogyan nyerjük ki a foszforilált fehérjéket?
A folt PBST vagy TBST mosással eltávolítható. Javasoljuk, hogy ne mossa le a blotokat desztillált vízben, mivel ez bizonyos körülmények között eltávolíthatja a fehérjéket. Blokkolja a membránt 5% w/v BSA-val TBST-ben. Inkubáljuk 1 órán át 4 °C-on keverés közben.
Hogyan méri a foszforiláció szintjét?
Western blottolás . A Western blot az arany standard a foszforiláció szintjének minőségi mérésére. A fehérjék SDS-PAGE-val történő elválasztása után a fehérjék a gélről egy membránra kerülnek, amikor feszültséget alkalmazunk (2. ábra).
Hogyan mutatható ki a tirozin foszforilációja?
Az olyan monoklonális antitestek (mAb-k) kifejlesztése, amelyek szinte az összes foszforilált tirozin maradékot felismerik, függetlenül a környező szekvenciáktól, lehetővé teszi a kutatók számára a fehérjék foszforilációs állapotának kimutatását az anti-foszfotirozin Western blotting segítségével.
Tippek és trükkök: Phospho Western Blots
Hogyan teszteled a tirozint?
A tirozin (Tyr) egy aromás aminosav, amely kritikus fontosságú az olyan vegyületek szintézisében, mint a neurotranszmitterek és a melanin. A plazma/vizelet rendellenes Tyr-koncentrációi biomarkerként is használhatók különféle betegségek, például alkaptonuria, tirozinemia és májbetegség kimutatására.
Hogyan figyeled a foszforilációt?
A kutatók számos technikát alkalmaznak a fehérjefoszforiláció kimutatására és mennyiségi meghatározására, beleértve a kinázaktivitás-vizsgálatokat , foszfo-specifikus antitesteket, Western-blot-t, enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatokat (ELISA), sejtalapú ELISA-t, intracelluláris áramlási citometriát, tömegspektrometriát és több analit profilalkotást. .
Hogyan növeli a foszforilációt?
A glükóz foszforilációja fokozható a fruktóz-6-foszfát megkötésével, és csökkenthető a fruktóz-1-foszfát megkötésével . Az étrendben elfogyasztott fruktóz a májban F1P-vé alakul. Ez tagadja az F6P hatását a glükokinázra, ami végső soron az előrehaladó reakciót kedvez.
A foszforiláció specifikus?
A foszforiláció mechanizmusa. Míg a foszforiláció egy elterjedt poszttranszlációs módosítás (PTM) a fehérjeműködés szabályozására, csak három aminosav, a szerin, a treonin és a tirozin oldalláncainál fordul elő eukarióta sejtekben.
A foszforiláció inaktiválhatja a fehérjét?
A fehérje foszforilációja aktívvá vagy inaktívvá teheti. A foszforiláció vagy aktiválhat egy fehérjét (narancs), vagy inaktiválhat (zöld) . ... A foszfatáz egy enzim, amely defoszforilálja a fehérjéket, hatékonyan megszüntetve a kináz működését.
Leblokkolhatom a membránt egyik napról a másikra?
Ügyeljen arra, hogy blokkolja Általában 1-5%-os blokkoló oldatot javasolnak. Egy órán át szobahőmérsékleten vagy egy éjszakán át 4 fokon keverés közben blokkoljuk. A blokkoló oldatokat frissen kell készíteni, mivel a baktériumok növekedése magas hátteret okozhat.
Az ATP foszforilálható?
Oxidatív foszforiláció Egy eukarióta sejtben a reakciók a mitokondriumokon belül mennek végbe. ... Amikor az ATP defoszforilálódik , a foszfátcsoport hasítása energiát szabadít fel a sejt által felhasználható formában. Az adenozin nem az egyetlen bázis, amely AMP, ADP és ATP foszforilációján megy keresztül.
Hogyan készül a lízispuffer a fehérje extrakcióhoz?
- Készítsen 100 mM oldatot kétszer desztillált vízben.
- Állítsa a pH-t 9,0-ra HCl-lel.
- Forraljuk színtelenné. ...
- Szobahőmérsékletűre hűtjük.
- Állítsa újra a pH-t 9,0-ra.
- Forraljuk színtelenné.
- Ezt a ciklust addig ismételjük, amíg az oldat pH-ja 9,0 marad a forralás és lehűtés után.
Hogyan aktiválódnak a kinázok?
Az aktiválást a ciklikus AMP szabályozó alegységekhez való kötődése közvetíti , ami a katalitikus alegységek felszabadulását okozza. A cAPK elsősorban citoplazmatikus fehérje, de aktiválódáskor a sejtmagba vándorol, ahol a génszabályozás szempontjából fontos fehérjéket foszforilálja. Domain mozgások a protein kinázokban.
Miért fontos a foszfoproteomika?
A foszfoproteomikai elemzések ideálisak a jelátviteli hálózatok dinamikájának tanulmányozására . ... A sok fehérje globális foszforilációs állapotának különböző időpontokban történő mérésének képessége ezt a megközelítést sokkal erősebbé teszi, mint a hagyományos biokémiai módszerek a jelátviteli hálózat viselkedésének elemzésére.
Hogyan észlelhetők a kis peptidek?
A Tris-tricine gél jobb felbontást biztosít. Ha csak a peptidet szeretné kimutatni, továbbra is a Mass Spec a legjobb módja a peptid azonosságának megerősítésére. A kis peptid kevésbé kötődik a Coomassie briliánskékhez, mint a nagyobb fehérje. Így a kisebb peptideket nehezebb Coomassie-festéssel vagy ezüstfestéssel kimutatni.
A foszforiláció mindig növeli az enzimaktivitást?
A foszforiláció mindig növeli az enzimaktivitást? Bár kényelmes lenne egy olyan modell, amelyben a foszforiláció mindig növeli egy enzim aktivitását, a biokémia nem olyan kedves velünk. Valójában nem tudjuk megjósolni, hogy a foszforiláció növeli vagy csökkenti egy enzim aktivitását.
Hol történik a foszforiláció?
Az oxidatív foszforiláció a belső mitokondriális membránban megy végbe, ellentétben a citromsavciklus és a zsírsav-oxidáció legtöbb reakciójával, amelyek a mátrixban játszódnak le.
Mi történik, ha a protein kináz aktiválódik?
A protein-kináz A-t (PKA) a ciklikus AMP (cAMP) megkötése aktiválja, ami konformációs változáson megy keresztül . Ahogy korábban említettük, a PKA ezután más fehérjéket foszfoilez egy foszforilációs kaszkádban (amihez ATP hidrolízisre volt szükség).
Milyen enzim katalizálja a foszforilációt?
A biokémiában a kináz egy olyan enzim, amely katalizálja a foszfátcsoportok átvitelét nagy energiájú, foszfát-donor molekulákról specifikus szubsztrátokra. Ezt a folyamatot foszforilációnak nevezik, ahol a nagy energiájú ATP-molekula egy foszfátcsoportot ad át a szubsztrát molekulának.
A defoszforiláció aktiválja vagy deaktiválja?
A foszfatázok katalizálják a defoszforilációt. ... A defoszforiláció aktiválhatja vagy deaktiválhatja a szubsztrátot , és lehetővé teheti vagy letilthatja a fehérje-fehérje kölcsönhatásokat, így szerves szerepük van a jelátviteli útvonalakban.
Milyen gyors a foszforiláció?
A jellegzetes foszforilációs idő a receptorok esetében 13 és 35 másodperc között volt, míg a downstream kinázoké 25 és 200 másodperc között volt.
Hány foszforilációs hely van?
25 ilyen szekvencia létezik, és 12 helyről számoltak be foszforiláltnak (narancssárga). A C-terminális oldalakon lévő, ismerten foszforilált helyet zöld szín jelzi.
Hogyan állapítható meg, hogy valami foszforilált?
Az antitestek hatékony eszközként használhatók annak kimutatására, hogy egy fehérje foszforilálódott-e egy adott helyen. Az antitestek kötődnek a fehérje foszforiláció által kiváltott konformációs változásaihoz, és kimutatják azokat. Az ilyen antitesteket foszfospecifikus antitesteknek nevezik; ma már több száz ilyen antitest áll rendelkezésre.