Lehet ponceau foltot blokkolás után?
Pontszám: 4,6/5 ( 35 szavazat )Bár a Ponceau-folt nem akadályozhatja az antitestek megkötését , lefényképezheti a Ponceau-festett membránt, majd néhány percre nagy mennyiségű vízbe áztatva eltávolíthatja a Ponceau-t. Ne aggódj emiatt. A Ponceau festés csak az átvitel hatékonyságának ellenőrzésére szolgál.
Használhatja a Ponceau foltot blokkolás után?
Bár a Ponceau-folt nem akadályozhatja az antitestek megkötését , lefényképezheti a Ponceau-festett membránt, majd néhány percre nagy mennyiségű vízbe áztatva eltávolíthatja a Ponceau-t. Ne aggódj emiatt. A Ponceau festés csak az átvitel hatékonyságának ellenőrzésére szolgál.
Miért használna valaki Ponceau S-t az AB HRP színfejlesztés vagy a Coomassie helyett?
A Ponceau S festési protokoll körülbelül 20 percet vesz igénybe, nem mérgező , és kíméletesebb megoldás, mint a Coomassie Brilliant Blue. A Ponceau S festőoldat nem rögzíti a fehérjét, lehetővé téve a Western blot analízist a festés után, ami egy másik kulcsfontosságú szempont.
Használhatja újra a Ponceau foltot?
Merítse a transzfer membránt Ponceau S festékoldatba enyhe keverés közben 5 percig. 2. Dekantálja a foltot, és többször öblítse le a membránt vízzel, amíg a fehérjecsíkok láthatóvá nem válnak. Ne használja újra a foltot ; ez reprodukálhatatlan eredményeket fog eredményezni, mivel a festék kimerül az első használat után.
Milyen színűre festi a Ponceau a fehérjéket a membránon?
Ebben a protokollban a nitrocellulóz vagy PVDF membránt ultratiszta H 2 O-val öblítik a fehérjék átvitele után. A Ponceau S festéket savas vizes oldatként alkalmazzuk, és a membránon lévő fehérjéket vörös színnel festjük.
Western Blot - Ponceau S festés
Mi értelme blokkolni a membránt 5%-os tejben?
A blokkolás a Western blot nagyon fontos lépése, mivel megakadályozza, hogy az antitestek nem specifikusan kötődjenek a membránhoz. A blokkolást gyakran 5% BSA-val vagy TBST-ben hígított zsírmentes szárított tejjel végzik a háttér csökkentése érdekében.
Befesthetem a gélt Ponceau-val?
A Ponceau S- vel a membránt festheti meg, nem a gélt. Ha szeretné megjeleníteni a fehérjéket a gélben, próbálja ki a Coomasie Blue-t.
Mit mutat a Ponceau-folt?
A Ponceau S egy gyors és reverzibilis festék a Western blot membránokon lévő fehérjesávok kimutatására, és használható PVDF-, nitrocellulóz- és cellulóz-acetát-membránokkal*. ... Mivel a Ponceau-S festődés reverzibilis, további immunológiai kimutatást tesz lehetővé.
Hogyan készítsünk Ponceau S megoldást?
- 500 ml ponceau S festőoldat elkészítéséhez adjunk 25 ml jégecetet 400 ml desztillált vízhez.
- Adjunk hozzá 0,5 g ponceau S tetranátrium sót a fent elkészített ecetsavhoz.
- Keverje fel a keveréket, hogy feloldódjon.
- Töltsük fel az oldatot desztillált vízzel 500 ml-re.
Fluoreszkál a Ponceau?
A Ponceau festés még alapos festés után is autofluoreszcens maradékot hagyhat a membránon , ami növeli a háttér fluoreszcenciáját.
Melyik az érzékenyebb Coomassie blue vagy Ponceau S?
A Coomassie briliánskék R250 és az amido fekete 10B érzékenyebb, mint a Ponceau S 2 . Azonban a Coomassie briliánskék R250-nél a háttér foltosodása erős, és ez a folt sem távolítható el könnyen.
Miért fest a Coomassie Blue?
A Coomassie Blue festést a poliakrilamid gélek fehérjesávjainak megfestésére használják . ... A festék azonban erősebben kötődik a fehérjékhez, mint a gélmátrixhoz, így a festéket utólag csak a gél fehérjementes részeiről lehet eltávolítani hasonló oldószerrel, amelyből a festéket kihagyjuk. Ez a destain.
Miért használnak SDS-t a Western-blotban?
Az SDS-t általában pufferként használják (valamint a gélben is), hogy minden jelenlévő fehérjét egyenletesen negatív töltéssel kapjanak , mivel a fehérjék lehetnek pozitív, negatív vagy semleges töltésűek. ... A gélelektroforézis lépést a Western blot analízis tartalmazza, hogy megoldja az antitestek keresztreaktivitásának kérdését.
Mi az a Coomassie-kék festés?
Leírás. A Coomassie blue festékek egy olyan festékcsalád, amelyet általában fehérjék megfestésére használnak SDS-PAGE gélekben . A géleket festékbe áztatják, majd a felesleges foltot oldószerrel eluálják ("festésmentesítés"). Ez a kezelés lehetővé teszi a fehérjék kék sávokként való megjelenítését tiszta háttéren.
Hogyan fested a nitrocellulóz membránt?
- Helyezze a blot transzfer membránt egy műanyag dobozba. ...
- Öblítse le vízzel négyszer 5 percig.
- Fessük SYPRO Ruby protein blot festékkel 15 percig. ...
- Öblítse le vízzel négyszer-hatszor nitrocellulóz és 2-3 alkalommal PVDF esetén 1 percig, majd szárítsa meg levegőn.
Miért festjük Ponceau S-vel?
A Ponceau S festés egy gyors és reverzibilis festési módszer, amelyet fehérjesávok kimutatására használnak Western blot membránokon , polivinilidén-fluoridon (PVDF), nitrocellulózon és cellulóz-acetát membránokon. ... A Ponceau S folt visszafordítható; ez a minőség hasznossá teszi a további immunológiai kimutatáshoz.
A Ponceau S mérgező?
ponceau S (6226-79-5) Célszervi toxicitás – egyszeri expozíció Légúti irritációt okozhat. Tünetek/hatások bőrrel való érintkezést követően : Égési sérülések. Tünetek/hatások szemmel való érintkezést követően: Súlyos szemkárosodás. Tünetek/hatások lenyelés után : Égési sérülések.
A Ponceau fényérzékeny?
*Megjegyzés: A Ponceau S fényérzékeny .
Hogyan fested az ezüstöt?
- Rögzítse a gélt fixáló oldatban (40% etanol, 10% ecetsav, 50% víz) 30 percig.
- Kezelje a gélt fehérjekezelő oldattal (20% etanol, 5% ecetsav, 75% víz, 4 mg ditiotreitol) 30 percig.
- Öblítse le a gélt 0,5%-os dikromáttal 5 percig.
- Öblítse le a gélt vízzel 5 percig.
Membránon használva Mit csinál a Ponceau S Hogyan képes erre?
A Ponceau S egy negatív festés, amely a fehérje pozitív töltésű aminocsoportjaihoz kötődik . Ezenkívül nem kovalensen kötődik a fehérje nem poláris régióihoz. (Megjegyzés: A Ponceau S nem alkalmas nylon membránokhoz.) A Ponceau S festőoldat 0,1% Ponceau S-t (w/v) és 5,0% ecetsavat (w/v) tartalmaz.
Coomassie festett gél után át lehet vinni?
A normál coomassie-val történő festéshez a gél rögzítése szükséges, így nem fog átvinni. Átvitel után megfestheti a gélt .
Mi a különbség a PVDF és a nitrocellulóz membránok között?
A PVDF membránok nagyobb fehérjemegkötő képességgel rendelkeznek, mint a nitrocellulóz . A PVDF fehérjekötő képessége 150-200 µg fehérje / cm2, a nitrocellulóz pedig 80-100 µg fehérje / cm2. Bár a PVDF-nek nagyobb a kötési kapacitása, ez bizonyos körülmények között megnövekedett hátteret eredményezhet.
Amikor a fehérjesávok nitrocellulózba kerülnek?
Kérdés: A fehérje átvitele az elektroforetikus gélről a nitrocellulóz membránra az úgynevezett. c) Western blotting technikát alkalmaznak fehérje transzferre poliakrilamid gélelektroforézisről (PAG) nitrocellulóz membránon. A Northern blottingot RNS átvitelre, a Southern blottingot pedig a DNS átvitelre használják...
Blokkolás után mosogatsz?
Általános blokkolási eljárások A blokkolási lépést követően általában elegendő mosást végeznek a felesleges fehérje eltávolítása érdekében, amely megakadályozhatja a célantigén kimutatását. Sok kutató azonban nem mossa le a blokkoló lépés után, mert hígítja az elsődleges antitesteket a blokkoló pufferében.